载脂蛋白M对1–磷酸鞘氨醇受体–1表达的影响
编辑:管理员   发布时间:2017-08-30 08:19浏览量:104

中华肥胖与代谢病电子杂志2017年5月第3卷第2期

王敏,罗光华等 中华肥胖与代谢病电子杂志


动脉粥样硬化是一种慢性心血管疾病,血管炎症在其发生发展中可能发挥着重要作用。高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)具有抗动脉粥样硬化的功能,原因可能是它具有抗炎和保护血管内皮的作用[1-2]。人载脂蛋白M(apolipoprotein M,apoM)是HDL的关键组成部分,已有研究表明,apoM基因rs805296位点的基因多态性与冠心病的发生密切相关[3];apoM能通过1–磷酸鞘氨醇受体–1(sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1)来保护血管内皮屏障系统的完整性[4];apoM能通过载运1–磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)而与S1P1和S1P3结合,从而发挥抗内皮细胞凋亡的作用[5]。因此,apoM在HDL发挥抗炎、保护血管内皮的完整性方面可能起到了重要作用。apoM是S1P的生理性载体,与S1P和S1P受体信号通路共同组成了apoM-S1P轴[6]。S1P能够激活效应细胞膜上5种不同的受体亚型,继而激活多种细胞内的信号通路从而产生不同的生理学效应[7]。已有研究证实,apoM载运的S1P能够与S1P1受体结合从而发挥血管保护的作用[4]。然而,并没有研究对apoM和S1P1表达水平的相关性进行探讨,故本研究以此为目的,探讨apoM对S1P1表达水平的影响。


资料与方法


一、动物与材料


1.实验动物:在苏州大学实验动物中心SPF实验室饲养8~10周,体质量约25 g的无特定病原体(SPF)级C57BL/6雄性apoM基因野生型(apoM+/+)和apoM基因敲除型(apoM–/–)小鼠。apoM–/–小鼠由南京大学模式动物研究所构建。室内温度控制在19~24℃,噪音<60 dB,湿度50%~60%,设12 h明暗周期。小鼠饲料、垫料均经过高温消毒处理,饮水经高温灭菌处理,期间喂给小鼠基础饲料并允许其自由摄食饮水。

2.材料:人脐静脉内皮融合细胞(EA.hy926细胞)购自美国菌种保藏中心(ATCC);高糖DMEM细胞培养液(AB10201637)、PBS(AC10209969)购自美国Hyclone公司;胎牛血清、青霉素–链霉素混合溶液(1842944)、0.25%胰酶购自美国Gibco公司;RNA抽提试剂盒K352、Taq酶、4×dNTPs、10×PCR缓冲液、MgCl2等购自上海申能博彩生物科技有限公司;cDNA首链合成试剂盒K1622购自美国Thermo Fisher Scientific公司;总蛋白提取试剂盒BB-3101购自上海BestBio贝博公司;Western Blot试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;S1P1兔抗人或鼠抗体购自英国Abcam公司;GAPDH单抗及相应二抗购自上海Proteintech公司。


二、实验方法


1.动物实验:随机选取apoM+/+(实验组) 和apoM–/–(对照组)小鼠各8只。采用颈椎脱位法处死小鼠,取小鼠主动脉,按照RNA抽提试剂盒K352说明书的规定提取小鼠肝脏RNA,再按照cDNA首链合成试剂盒要求的方法将RNA逆转录成cDNA,然后采用RT-PCR法检测apoM和S1P1 mRNA的表达情况。比较实验组和对照组apoM和S1P1 mRNA的表达情况。

2.细胞实验:采用含10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液培养EA.hy926细胞株,加入100 U/ml的青霉素–链霉素混合溶液,培养于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。将载有人apoM基因表达序列的慢病毒按照20的感染复数,感染6孔培养板中的EA.hy926细胞,使慢病毒携带的apoM基因表达序列整合入EA.hy926细胞。与此同时,采用相同但不携带apoM基因序列的慢病毒感染EA.hy926细胞以构建对照组细胞。96 h后分别抽提两组细胞的总RNA和总蛋白。按照首链cDNA合成试剂盒要求的方法合成cDNA,再通过RT-PCR技术检测apoM和S1P1 mRNA的表达水平。按上述方式重复感染EA.hy926细胞,提取的细胞总蛋白经过BCA定量后再通过Western Blot法检测S1P1受体的过表达情况。比较实验组和对照组apoM和S1P1 mRNA及S1P1受体蛋白的表达情况。

3.实时荧光定量PCR:(1)引物和探针的设计与合成:用Primer Premier 5.0软件设计人和小鼠apoM、S1P1和GAPDH基因的引物和探针,序列详见表1,所有引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。(2)实时荧光定量PCR扩增:各种基因扩增均采用25 μl的反应体系,内含10×PCR缓冲液2.5 μl,5 U/μl Taq酶0.2 μl,10 mmol/L dNTP 1.0 μl,25 mmol/L MgCl2 2.3 μl,100 μmol/L目的基因和内参GAPDH的引物和探针各0.1 μl,cDNA 2 μl,加双蒸水补足反应总体积共25 μl。扩增反应条件为:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 5 s,58 ℃ 12 s,扩增40个循环。所有反应均在LightCycler 480 Ⅱ PCR仪上进行。(3)结果分析:荧光强度达到阈水平时的循环数为循环阈值(threshold cycle,Ct 值),对每一标本计算平均Ct 值,应用公式2–ΔCt计算mRNA的相对含量。以检测指标的mRNA含量与内照GAPDH mRNA的含量比值来表示待测基因的表达水平。



4.Western blot法检测EA.hy926细胞apoM、S1P1和GAPDH蛋白的表达水平:根据总蛋白提取试剂盒说明书的规定提取细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量,加入上样缓冲液混匀后,置100℃ 10 min进行蛋白变性,之后放置于冰上。将变性样本在80 V电压,12%十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离110 min后,在4℃环境中以120 mA电流2 h的方式将变性蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,之后用3%的BSA封闭1 h,再4℃孵育apoM单克隆抗体过夜,次日洗膜,加入二抗室温孵育2 h,再经ECL发光检测。将检测完毕的PVDF膜在室温下进行抗体剥离10 min,继续洗膜,加入一抗(S1P1和GAPDH单抗)、二抗,检测等步骤同第一次操作。

5.免疫组化染色:采用EnVisionTM免疫组化染色法。一抗为兔抗鼠单抗(1:50),二抗为山羊抗兔通用型二抗,切片经DAB显色,苏木精复染。免疫组化染色结果判定:S1P1阳性表达于细胞膜,用双盲法在高倍镜(×400)下对每张切片计数5个视野,按染色强度记分,并以此判定S1P1蛋白的表达水平。染色强度分别计为0~3分,无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。


三、统计学方法


采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行数据分析。实验组和对照组间的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。


结 果


一、EA.hy926细胞过表达人apoM对细胞表面S1P1 mRNA表达的影响


EA.hy926细胞过表达人apoM对细胞表面S1P1 mRNA表达的影响详见图1。由图1可见过表达人apoM的EA.hy926细胞的apoM mRNA表达量是对照组的3596.77倍(P<0.001),而S1P1 mRNA的表达量分别是对照组的1.67(P<0.001)和1.99倍(P<0.001)。





图1 EA.hy926细胞过表达人apoM 对细胞表面S1P1 mRNA 表达的影响。ApoMTgN表示不携带apoM 基因的慢病毒感染的EA.hy926细胞(对照组),ApoMTgH表示携带apoM 基因的慢病毒感染的EA.hy926细胞(实验组)。1A 为对照组和实验组细胞分别表达的apoM mRNA 水平;1B 为S1P1 受体基因S1P1-1F 转录本的转录水平;1C 为S1P1 受体基因S1P1-2F 转录本的转录水平



二、EA.hy926细胞过表达人apoM对细胞表面S1P1蛋白表达的影响


EA.hy926细胞过表达人apoM对细胞表面S1P1蛋白表达的影响详见图2。由图2可见过表达人apoM的EA.hy926细胞的S1P1受体蛋白的表达水平是对照组的1.37倍(P<0.05)。




图2 EA.hy926 细胞过表达人apoM 对细胞表面S1P1 受体蛋白表达的影响。ApoMTgN表示不携带apoM 基因的慢病毒感染的EA.hy926 细胞(对照组),ApoMTgH表示携带apoM 基因的慢病毒感染的EA.hy926 细胞(实验组)。2A 为对照组和实验组细胞S1P1 受体蛋白表达电泳图;2B 为对照组和实验组细胞S1P1 与GAPDH 灰度值的比较值


三、生理状态下apoM+/+小鼠与 apoM–/–小鼠主动脉中S1P1 mRNA 的表达差异


生理状态下apoM+/+小鼠与apoM–/–小鼠主动脉中S1P1 mRNA的表达差异详见图3。由图3可见apoM+/+小鼠主动脉中S1P1 mRNA的表达水平是apoM–/–小鼠的1.73倍(P<0.01)。



图3 生理状态下apoM+/+小鼠与apoM–/–小鼠主动脉中S1P1 mRNA的表达


四、生理状态下apoM+/+小鼠与 apoM–/–小鼠主动脉中S1P1蛋白 的表达差异


生理状态下apoM+/+小鼠与apoM–/–小鼠主动脉中S1P1蛋白的表达差异详见图4。由图4可见S1P1主要表达于内皮细胞膜,apoM+/+小鼠主动脉内皮中S1P1表达量高于apoM–/–小鼠。






图4 生理状态下apoM+/+小鼠与apoM–/–小鼠主动脉中S1P1 蛋白的表达。4A和4B为apoM–/–小鼠主动脉S1P1 蛋白的表达(HE染色和免疫组织化学染色,放大倍数×400);4C和4D为apoM+/+小鼠主动脉S1P1 蛋白的表达(HE 染色和免疫组织化学染色,放大倍数×400)。


讨 论


载脂蛋白M–1–磷酸鞘氨醇轴由Arkensteijn等[6]首次提出,它由apoM、S1P和受体组成,apoM可能通过载运S1P而与受体结合,从而调节S1P的相关信号通路。apoM的晶体结构研究显示其存在亲水性的连接口袋,此结构能与棕榈酸、硬脂酸和S1P等结合。S1P头部的磷酸能与apoM结合口袋入口处的精氨酸(Arg98和Arg116)和酪氨酸(Tyr100)发生特异性相互作用;S1P的氨基与apoM的谷氨酸(Glu136)、酪氨酸(Tyr102)和精氨酸(Arg143)通过氢键相互结合[8]。Christoffersen等[8]的研究表明,与apoM–/–小鼠相比,apoM高表达和apoM低表达小鼠体内的apoM浓度分别增加了10倍和2倍,S1P水平分别上升了267%和71%。Sutter等[9]的研究表明,HDL能通过apoM依赖性和非依赖性的方式促进红细胞分泌S1P;同时,apoM还能通过阻止S1P与肾脏内吞受体结合,从而阻止S1P被消除。由此可见,apoM不仅是S1P的生理性载体,还能影响S1P的分泌和清除。

大量文献证明,S1P是具有生物活性的脂质调节者,其对应的受体有5种亚型,即S1P1~S1P5,它们分别表达于不同的细胞。S1P可以通过apoM或白蛋白的载运而与效应细胞膜上的不同受体亚型结合,激活多条细胞内的信号通路从而对靶细胞进行干预。本课题组先前的研究表明,EA.hy926细胞主要表达S1P1~S1P3 3种受体,最主要表达S1P1受体[10]。S1P1受体分布广泛,高表达于内皮细胞、淋巴细胞和星形胶质细胞,主要生理功能有调节免疫、神经细胞迁移、心血管系统和神经系统的胚胎发育及血管形成和内皮屏障功能等[11]。本组研究表明,被携带apoM基因的慢病毒感染的EA.hy926细胞中的S1P1 mRNA水平明显高于对照组,且S1P1受体蛋白表达趋势与其一致,说明apoM能增加S1P1 mRNA和蛋白的表达水平。另外,apoM+/+小鼠主动脉中的S1P1 mRNA水平也明显高于apoM–/–小鼠,这再次证明了apoM能增加S1P1 mRNA和蛋白的表达水平。

apoM可以通过影响前β-HDL的形成而发挥抗动脉粥样硬化的作用[12],即HDL的抗炎作用可能部分通过apoM介导来完成,且多项实验已经证实了apoM的抗炎作用,如血小板活化因子等促炎因子能够增加apoM的表达和分泌[13];Gao等[14]运用TNF-α刺激HepG2细胞发现,apoM能够通过抑制核因子κB通路的活化而抑制细胞间黏附分子–1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子–1(VCAM-1)的表达,从而发挥抑制炎症反应和阻断血管事件发生的作用。此外,还有研究表明,S1P能够通过S1P1受体和S1P3受体途径刺激eNOS的表达,以此促进内皮性NO的产生和减少单核细胞的激活与粘附[15-16]。而本组研究证明,apoM能够促进S1P1的表达,故推测apoM能够通过促进S1P1受体的表达而激活eNOS信号通路,从而起到血管保护的作用。

综上所述,本组研究表明,apoM在内皮细胞内能够显著增加S1P1受体的表达,推测可能是apoM增加S1P的分泌从而反应性引起S1P1受体增多,但具体机制仍有待于进一步研究。


参考文献(略)


图文编辑:姜舒文,赵蕾